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      下載文件詳細資料
        文件名稱:  超聲破碎變異鏈球菌后蛋白質提取條件的優化研究
        公司名稱:  北京星越天成科技有限公司
        下載次數:   994
        文件詳細說明:
       

      摘要:

             尋找超聲破碎后高效率提取致齲菌變異鏈球菌蛋白質的蕞佳放置時間。方法 以裂解液為提取介質,采用超聲法破碎**。對比破碎前、后菌形態并將菌提取液分別放置0 、10 、30 、50 、70 min 收集蛋白上清液,通過RC DC 法測定蛋白質濃度及蛋白質SDS‐PAGE 電泳,比較放置不同時間后的蛋白質提取效果。結果 超聲破碎后,少部分細菌破碎不完全。RC DC法測定結果顯示,超聲破碎后放置30 min 時提取的蛋白質濃度高于其他各組(P < 0 .05) ,但SDS‐PAGE 電泳顯示蛋白質的條帶分布和豐度無明顯差別,推測蛋白質的釋放和溶解需要一定時間完成。結論 超聲法提取變異鏈球菌蛋白質后放置30 min 可顯著提高蛋白質提取效率。變異鏈球菌屬于革蘭陽性菌,細胞壁厚且堅韌難以破碎,一般采用的破碎方法有反復凍融結合超聲法、氧化鋁粉末混合研磨法、玻璃珠勻漿法以及高壓法等[6‐8] 。超聲波破碎法是目前提取**蛋白時常用的技術手段[9‐10] 。Thongboonkerd等[11]研究認為僅通過超聲即可使化膿性鏈球菌達到80% 的破碎,但無明確評價**破碎程度的指標。超聲破碎法在大大提高蛋白質提取效果的同時,還能增加蛋白質的溶解性[12] ,且可避免外源性蛋白質對樣本的污染[13] 。已有實驗表明超聲破碎變鏈菌效果明顯[9 ,14] ,而在變鏈菌蛋白質組研究中,如何提取樣本的*大量對結果至關重要。本實驗將超聲破碎結束的變鏈菌菌懸液分別放置不同時間,在菌體內的蛋白質充分溢出并溶解后,對其中的蛋白進行構成及量的測定,探索放置時間對菌懸液中蛋白質提取效率的影響。SDS‐PAGE 電泳可根據相對分子質量的不同分離混合蛋白質,是分析各蛋白質構成變化的有效手段[14] 。本實驗電泳結果顯示,超聲后放置不同時間的菌懸液中蛋白質的條帶分布及豐度基本相同,提示放置時間對菌懸液中蛋白質的構成無明顯影響,但對濃度的影響無法通過SDS‐PAEG 電泳**展示。本實驗采用的RC DC 試劑盒法以Lowry 法為基礎,并能夠兼容裂解液中多種試劑成分,同其他蛋白質定量測定方法相比,具有精密度高、準確性好等特點[15‐16] 。定量結果表明,超聲破碎后放置30 min 的菌懸液中蛋白質的濃度*高;放置時間少于30 min 的菌懸液,隨時間的延長蛋白質濃度逐漸升高,而超過30 min 所提取的蛋白質隨時間的延長濃度下降。經掃描電鏡觀察,大部分細菌破裂后呈絮狀碎片,極小部分細菌呈現清晰的殘余菌體形態,個別變鏈菌菌體較為完整。提示胞壁破裂完全的細菌胞內物質已充分外流,蛋白質等內容物的釋放較徹底。而形態完整的**胞壁上可能存在有較小的裂口,猜測它們和存在殘余菌體的變鏈菌胞內物質的釋放需要一定時間完成。在測定蛋白質質量濃度時,需保證菌體內釋放的蛋白質充分溶解于提取介質中。而當蛋白質的釋放量少,或出現蛋白降解、沉淀等情況時,即導致提取介質中蛋白質的溶解減少,使測量濃度偏低。本實驗采用的提取液中含有的脲和硫脲等可以充分破壞蛋白質之間形成的氫鍵,防止由氫鍵引起的蛋白質聚集。還原劑DTT 能夠幫助打開蛋白質的二硫鍵,促進半胱氨酸殘基被還原,使已變性的蛋白質展開更完全,溶解更徹底。而蛋白酶抑制劑PMSF 可有效抑制細菌自身所釋放的蛋白酶對蛋白質的降解。由數據可看出,蛋白質質量濃度與裂解后放置時間在0 ~ 30 min 范圍內成正相關。由此提示,一方面,蛋白質的釋放可能隨時間的延長增加;另一方面,提取介質中復雜的試劑成分與蛋白質、水解酶的相互作用可能并沒有伴隨裂解過程的結束而終止,而在裂解后的一段時間內繼續進行。同時,蛋白酶抑制劑PMSF 主要抑制絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶,而菌體內釋放的其他蛋白酶可能仍存在活性,它們在溶解后與蛋白質相互作用,導致蛋白質濃度的降低。但放置30 ~ 70 min 與蛋白質濃度的相關性無明顯規律,具體作用機制需進一步探索。

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